1. 연구개발의 필요성

 

 

가. 기술개발의 중요성 필요성
 

 

우리나라는 지난 40여년간 급속한 산업화가 진행되어 오면서 이로 인해 다양한 오염물질들이 주변 환경으로 배출 됨에 따라 수질 오염도가 급증하고 있는 실정이며 이에 따른 수생태계를 비롯한 환경 생태계가 급격히 파괴 되고 있음.
 

 

특히 다이옥신류, 환경호르몬류 비롯한 발암물질류는 극미량으로도 생태계를 파괴 및 교란시키며, 나아가 인간의 보건에 치명적인 위해를 가져오나 기존의 기기분석법으로는 시간 및 비용을 소요가 크며 분석이 난해하여 정확한 생태계의 영향을 분석하는 데에는 한계가 있음(Sumpter and Jobling, 1995).
 

 

이러한 단점을 극복하기 위해 환경오염 민감 생물종 지표 연구가 도입되고 있으나, 기존의 생물종을 이용한 생물 독성평가기법은 생물종의 생사여부나 활성도를 이용하여 생물종별 독성물질별 단편적인 독성정도 만을 평가 할 수 있어 심층적이고 복합적인 독성평가기법의 도입이 절실함.
 

 

이에 따라 생물종 내에서의 독성평가 기법이 도입되고 있으며, 대표적으로  환경호르몬 에 민감하게 반응하는 biomarker gene으로서 vitellogenin, CYP1A 및 AhR gene 등이 알려져 있고, 현재 이 이외에 다른 biomarker gene들의 hunting이 이루어지고 있다 (Eason and O'Halloran, 2002; Todorov et al., 2002; Hemmer et al., 2001, 2002; Vethaak et al., 2002).
 

 

그러나 이러한 biomarker gene을 통한 독성 평가는 이미 알려진 특정 독성 효과의 정도를 측정하고 한가지 유전자에 미치는 영향을 평가하는 점에서는 강점을 보이지만 생명체 내부에서의 독성의 전반적인 효과와 독성에 관계되는 유전자간의 복잡한 유연 관계를 설명하고 평가하는데에는 한계가 있음.(Min et al, 2003)
 

 

선진국에서는 환경변화에 높은 내인성을 지니지만 발암원, 돌연변이원, 기형유발원등의 오염물질에 대해서는 높은 민감도를 지니는 송사리, 점박이송사리, 무당개구리 및 저서성 플랑크톤을 이용한 연구가 DNA chip 및 Real-time PCR등의 유전체 독성학(Toxicogenomics) 기반의 첨단과학기술을 이용하여 이루어지고 있음
 

 

현재 생명체의 cDNA를 유리기판위에 고밀도로 첨착 시킨 유전자 칩과 정량적인 방법으로 개별 유전자 발현을 진단 가능한 Real-time PCR기법은  첨단 진료의학분야와 신약개발 분야에 활발히 도입되고 있는 실정이며 (Roger and  Stephen, 2002), 이러한 유전체 독성학(Toxicogenomics)기반 신기술을  환경분야에 도입함으로서 기존 생물지표 연구를 통한 독성평가에서 할 수 없었던 high through-put 분석을 가능하게 할 수 있으며, 광범위한 오염물질에 대한 독성효과를 분자 수준에서의 분석을 가능하게 해주며, 특정 독성물질에 대한 독성분석을 통한 독성영향 분류도 꾀할 수 있음.
 

 

또한 경제적 산업적 측면에서 볼 때 한 가지 유해화학물질에 대한 독성 분석시, US$2-4 million 정도의 비용이 소요되어(Neumann and Galvez, 2002) 경제적인 부담이 컸으나, 다량의 유전정보를 포함하고 있는 유전자 칩을 활용한 방법의 적용시에는 특정 화학물질에 대한 생물체의 피해 정도를 신속하고 보다 저렴하게 분석할 수 있으며 연구를 통해 개발된 유전체 독성학(Toxicogenomics) 기반 독성평가기법은 기술화를 통해 기술대체 및 수입대체효과를 통해 산업적 측면 기여가능.
 

 

본 연구는 체계적인 유전체독성학 (Toxicogenomics)기반 생물지표연구를 통해 생태계의 위험을 예측하고 관리 할 수 있는 기초를 제공함으로서,NRTM에서 제시하고 있는 '건강한 생명사회 지향'과 '환경 에너지 프론티어 진흥'에 잘 부합되는 과제라 할 수 있고 특히 전략제품 기능의 포트폴리오 분석에서도 생체 진단기기 시약분야에서 2010년 까지 1.590억 미 달러의 경제적 파급효과와 성공 가능성이 매우 높은 기술로 분류되어 있으며 기속 가능한 자연 생태계 관리 측면에서도 자연환경과 조화되는 쾌적한 삶 유지에 필수가 되는 공공기반성이 강한 기술이라 할 수 있음(2002 NTRM).
 

 

최종적으로 본 연구는 유전체독성학 (Toxicogenomics)기반에서 유전자칩과 Real-time PCR 방법을 기본으로 하여 새로운 분자 수준의 지표를 개발하고 이를 이용하여 환경오염에 따른 생태계의 위해성을 확인하고, 이에 따른 생태계의 파괴 및  생물종에 미치는 위험성을 예측함으로서 환경 위해성을 나타내는 독성물질의 사용을 제한 및 관리함으로서 자연환경을 안전하게 보전하는데 그 목적이 있으며 또한 미시적 관점에서는 이미 방출되어진 특정독성물질의 생물체에 대한 영향을 정확히 평가함으로서  그 피해를 최소화 할 수 있는 방법을 강구하고 동시에 효과적으로 독성물질에 대한 관리를 기 할 수 있음.

 

나. 국내외 관련기술의 현황
 

 

국외

이미 유럽 미국 일본 같은 선진국에서는 지표생물별 독성영향평가가 활발히 이루어지고 있다. 특히 G7, EPA guideline에 의해 그 실험법과 규제가 확립되어 있으며, 넙치류 장어류 및 조개류의 수서 생물체를 이용한 분자 생물지표 연구가 활발히 진행되고 있는 실정이다. 독일 베를린 공대의 생태독성실험실에서는 물고기 난황단백질(vitellogenin)을 검출하는 방법과 조개류의 면역세포 시험법이 적용되고 있으며, 특히 막스 플랑크 연구소에서는 환경 독성 평가를 위한 zebra fish의 유전자칩을 개발하는 연구를 수행하고 있다. 미국에서는 기존 바이오 마커 연구에 널리 사용되는 물벼룩이나 무지개송어 무당개구리의 유전자칩을 이용한 독성평가가 여러 그룹에서 활발히 추진되고 있으며, 일본에서는 송사리 유전자칩을 만들기 위한 콘소시움이 구성되어 있다. (Arukwe et al., 1999; Kloasy et al., 1999; Oppen-Bernsten et al., 1999; Celius et al., 2000; Schultz et al., 2000; Lee et al., 2002). 그러나 국외에서도 유전자 칩과 Real-time PCR (실시간 중합효소 연쇄반응법)을 동시에 기반 기술로 활용하는 유전체 독성학 (Toxicogenomics)기반 분자생물지표 연구는 이제 막 태동하는 단계이다.

 

 

국내

국내 일부 대학 및 연구소에서 물고기나 양서류를 이용한 바이오 마커 선정 연구가 진행되고 있다. 이들 대학이나 연구소는 물고기의 일부 유전자를 활용하여 독성효과를 평가하는 데에 그치고 있어 생명체에 미치는 종합적인 독성효과를 평가하지는 못하고 있는 실정이다. K대학교에서는 설치류를 이용한 분자수준의 생물지표 선정연구를 진행 중에 있으나 아직 초보적인 기초연구 단계에 있으며, H대학에서는 양서류를 이용하여 내분비계 장애물질의 발생독성 연구 및 독성기작에 대한 연구를 수행 중에 있으나 이 역시 기초연구 단계에 머물러 있다. 국내 K연구소에서는 녹조류 물벼룩 송사리등의 생명체를 가지고 생물지표 연구를 하고 있으나 분자수준의 생물지표 연구에는 이르지 못하고 있는 실정이다.

 

다. 국내외 유사기술과의 차별성
 

 

 

본 연구실 이미 송사리 유전자칩을 개발하여 특정 독성물질에 대한 독성평가가 완료된 상태이며(그림 1. 가,나,다), 이 유전자칩은 120개의 송사리 유전자가 어레이 되어있어 상당량의 데이터 베이스를 확보하고 있는 상태이다. 이를 바탕으로 본 과제를 통해 송사리 유전자칩을 더욱 발전시켜 2000개이상의 유전자를 포함하는 유전자칩의 확장을 계획하고 있으며, 이는 다른 연구 그룹이 단일 유전자나 초기의 유전차칩을 도입하려는 시도보다 상당 수준 앞서있어 기술의 우위를 점할 수 있고 특히 송사리 유전자칩 부분에서는 해외 특허(일본 특허 출원 #2002-360331 2002.12.12)를 출원 하는등 세계적 수준의 기술을 보유하고 있다

 

 

 

 

그림 1. (가) Japanese medaka에 150 uM phenol을 노출 시킨 후 유전자 발현 패턴 분석 결과
           (가) 1 일, (나) 10일 후, (다) Japanese medaka 에 EDCs 류, 페놀등을 각각 1일 10일 동안
           노출 시킨 후 유전자 발현 패턴을 clustering 한 결과.

 

 

 

또한 본 연구실은 실시간 중합효소연쇄반응기법 (Real-time PCR)을 이용하여 특정 유전자의 발현 양상을 정확히 분석할 수 있는 기술을 보유하고 있어서, 송사리 유전자칩을 통해 얻은 분자수준의 생물지표 후보군에 대하여 정밀하게 발현 양상을 얻어 낼 수 있어 더욱 정확하고 신속하게  분자수준의 생물지표를 선정해 낼 수 있다.(그림2)(Min et al, 2003). 이와 같이 유전자칩과 실시간 중합효소연쇄반응기법을 결합함으로서 타 연구실에서 수행할 수 없는 high through-put 분자수준의 생물지표 선정이 가능하며 이를 real time PCR을 통해 분석함으로서 체계적이고 정확한 유전체독성학 (Toxicogenomics) 기반 독성평가 기법을 얻을 수 있다.
 

 

 

 

 

그림2. real-time PCR을 이용 베타액틴, 에스트론젠 리셉터, 아로마테이즈, p53의 발현 양상 분석

 

라. 연구개발사업성과의 사업화 가능성
 

 

 

1차년 연구를 통해 개발된 송사리 유전자칩은 2차년의 유전자칩 검증과 3차년의 평가기법 개발을 통해 환경독성효과를 평가 할 수 있는 툴로 사용될 수 있다.

 

바. 기술개발시 예상되는 파급효과 및 활용방안
 

 

실시간 중합효소연쇄반응기법 (Real-time PCR)을 이용하여 특정 유전자의 발현 양상을 정확히 분석할 수 있는 기술을 보유하고 있어서, 송사리 유전자칩을 통해 얻은 분자수준의 생물지표 후보군에 대하여 정밀하게 발현 양상을 얻어 낼 수 있어 더욱 정확하고 신속하게  분자수준의 생물지표를 선정해 낼 수 있으며, 유전자칩과 실시간 중합효소연쇄반응기법을 결합함으로서 타 연구실에서 수행할 수 없는 high through-put 분자수준의 생물지표 선정이 가능하며 이를 real time PCR을 통해 분석함으로서 체계적이고 정확한 유전체독성학 (Toxicogenomics) 기반 독성평가 기법을 얻을 수 있다.
 

 

3년간의 집중 연구를 통해 현재 전세계적으로 초기 연구 단계에 있는 Toxicogenomics 분야의 학술적인 성장을 꾀 할 수 있으며, 환경 호르몬 및 발암물질에 민감하게 반응하는 많은 분자수준 생물지표에 대한 구체적으로 정량화된 DB 확보 대량의 기능성 유전자를 포함한 물고기 유전자칩의 개발을 통하여 국내 Toxicogenomics 분야의 개발 촉진과  국가 과학기술 발전에 크게 이바지함

 

 

 

 

2. 목표 및 내용

 

가. 최종목표
 

 

단순 생태영향 모니터링 체계에 그치고 있는 현재의 환경 위해성 평가를 한 단계 진일보시키기 위하여 이미 본 연구실에서 수행된 바 있는 송사리 유전자칩과 Real-time PCR 기법을 이용한 유전체 독성학 (Toxicogenomics) 기반 환경독성평가 기법을 더욱 발전시켜 다양한 분자수준 생물지표를 확보하고 실제 환경현장에 적용시킬 수 있는 기술 수준으로 발전시키기 위하여 기존의 유전자칩을 확장 제작한다.
 

 

1차년도 연구를 통해 확장 제작된 유전자칩을 통해 분자수준의 생물지표 후보군을 선정함과 동시에 Real-time PCR기법을 바탕으로 환경독성에 민감한 반응을 보이는 분자수준의 생물지표를 검증하며, 다각적이고 입체적인 환경독성 평가를 가능하게 해주는 바이오 마커를 선정한다.
 

 

선정된 분자수준의 생물지표와 유전자칩 Real-time PCR 기법을 적극활용 분자 생물지표에 의한 환경 오염 평가 체계를 구축함과 동시에 독성물질 예측 평가 기법을 다지며, 나아가 환경 산업 뿐 아니라 관련기술전반으로의 적극적인 기술 확산을 통해 국내 환경 산업 및 관련기술사업을 비약적으로 발전시켜 국가의 기간산업으로서의 기틀을 다지는 데 기여함

 

 

 

 

그림 3. 연구 개발의 최종목표

 

나. 기술개발 추진체계
 

 

 

 

 

 

 

그림4. 기술개발추진 체계